יצירה מפורסמת זו צוירה בין השנים 1495 ל-1498על גבי קיר הרֶפֶקְטוֹריוּם - חדר האוכל של המנזר הדומיניקני סנטה מריה דלה גרציה שבמילאנו. החלל של היצירה כמו מגדיל את חלל חדר האוכל וכמו מוסיף חדר נוסף שבו מתרחשת הסעודה האחרונה על כל משתתפיה ופריטי המזון והכלים. החידוש העיקרי שביצירה זו הוא תיאור רגע השיא של דרמה פסיכולוגית המתרחשת אל מול עיני הצופה.
זוהי אחת מיצירותיו החשובות ביותר של דה וינצ'י, וללא ספק מסמלי הרנסנס בשיאו. היצירה צוירה בטכניקה ניסיונית אשר לא צלחה. הטכניקה המקובלת - ציור פרסקו (פרסקו = טרי) היא ציור על גבי קיר המכוסה שכבת טיח רטוב. את הטיח מספיגים בצבע כך שכאשר הוא מתייבש הטיח עצמו צבוע, דבר המבטיח עמידות רבה. דה וינצ'י שילב טכניקה מסורתית זו יחד עם צבעי שמן וצבעי טמפרה (צבעים על בסיס חלבון ביצה), כנראה כיוון שרצה להגיע לדיוק רב בהבעות הפנים והתנועה. בגלל הטכניקה הזו לאורך השנים היצירה נהרסה, כך שחלקים גדולים ממנה הלכו לאיבוד ונזקקו לאחרונה לרסטורציה. "הסעודה האחרונה" הייתה אבן נגף בעבור האמן: כפי שמעיד חוקר האמנות הרנסנסי ג'ורג'יו ואזארי הוא התלבט רבות בהכנתה, וגם הותיר כמות גדולה מאוד של סרטוטי הכנה.
ביצירה מתוארת סצנת "הסעודה האחרונה" שערך ישו לתלמידיו בגן בגת שמנים ערב לפני שנתפס בידי הרומאים. סעודה זו היא בעלת משמעות מרכזית בדת הנוצרית, כיוון שבה הודיע ישו לתלמידיו כי אחד מהם, יהודה איש קריות, בגד בו וכי הוא מקריב את עצמו למען ישועת האנושות. בהמשך הוא הגיש להם את היין והלחם, והצהיר כי אלו הם דמו ובשרו. שתיית היין ואכילת הלחם משמשים עד היום בטקסי המיסה הנוצרית, ומסמלים את קרבנו של ישו.
קיים ויכוח האם מדובר בסדר הפסח. בבשורה על פי יוחנן, פרק י"ג נפתח במילים "הָיָה זֶה לִפְנֵי חַג הַפֶּסַח", ובהמשך כתוב: "הוֹאִיל וְהַקֻּפָּה הָיְתָה אֵצֶל יְהוּדָה, חָשְׁבוּ אֲחָדִים שֶׁיֵּשׁוּעַ אָמַר לוֹ, 'קְנֵה מַה שֶּׁנָּחוּץ לָנוּ לֶחָג', אוֹ שֶׁיִּתֵּן מַשֶּׁהוּ לָעֲנִיִּים". על-פי טקסט זה אסף ישו כסף כדי לסייע לאביונים לקראת סדר הפסח, וסעודה זו התקיימה ערב אחד לפניו. במרקוס י"ד כתוב: "בָּרִאשׁוֹן לְחַג הַמַּצּוֹת, בַּיּוֹם שֶׁנָּהֲגוּ לִזְבֹּחַ אֶת קָרְבַּן הַפֶּסַח, שָׁאֲלוּ אוֹתוֹ תַּלְמִידָיו: 'לְאָן אַתָּה רוֹצֶה שֶׁנֵּלֵךְ וְנָכִין לְךָ לֶאֱכֹל אֶת הַפֶּסַח?' הוּא שָׁלַח שְׁנַיִם מִתַּלְמִידָיו בְּאָמְרוֹ לָהֶם: 'לְכוּ הָעִירָה וְיִפְגֹּשׁ אֶתְכֶם אִישׁ נוֹשֵׂא כַּד מַיִם. לְכוּ אַחֲרָיו, וּבַמָּקוֹם אֲשֶׁר יִכָּנֵס אֵלָיו אִמְרוּ לְבַעַל הַבַּיִת, 'כֹּה אָמַר רַבֵּנוּ: אֵיפֹה חַדְרִי אֲשֶׁר אֹכַל בּוֹ אֶת הַפֶּסַח עִם תַּלְמִידַי?' אוֹתוֹ אִישׁ יַרְאֶה לָכֶם עֲלִיָּה גְּדוֹלָה מֻצַּעַת וּמְסֻדֶּרֶת; שָׁם תָּכִינוּ לָנוּ.' יָצְאוּ תַּלְמִידָיו וּבָאוּ הָעִירָה. הֵם מָצְאוּ הַכֹּל כְּפִי שֶׁאָמַר לָהֶם וְהֵכִינוּ אֶת הַפֶּסַח". לפי טקסט זה אכן מדובר בערב הפסח.
דה וינצ'י מיקם את הסצנה בחדר אוכל ולא בטבע כמתואר בברית החדשה. הסיבה לכך היא כנראה רצונו להוסיף אשליית גודל לחלל חדר האוכל של המנזר וכן לבחון את הפרספקטיבה המתמטית של הרנסנס, שחוקיה התנסחו בתקופה זו. קווי הקירות המקבילים הולכים ומתקצרים, כאילו נפגשים (הקצרה), וכך גם קווי התקרה, המעוצבת על-פי מסורת הרנסנס ב"קסטונים" (ריבועים מפוסלים היוצרים רשת צפופה, כמעין גריד על-גבי התקרה).
לפי הברית החדשה הסעודה נערכה בערב, לאחר שקיעת החמה. לפי החלונות האחוריים ביצירה של דה וינצ'י הסעודה נערכה ביום. ביצירה קיים מקור אור נוסף, הבוקע מצד שמאל, בדיוק מהאזור שבו ממוקמים דלת חדר האוכל (האמתי) וחלון. השינוי בתיאור השעה ותוספת האור משמאל מעידים גם הם על רצונו של האמן "להרחיב" באופן אשלייתי את החלל של חדר האוכל, שבו משתמשים בעיקר בשעות היום.
דה וינצ'י בחר לתאר את הרגע מיד לאחר הודעתו הדרמתית של ישו, שגרמה לתגובה מידית וסוערת של השליחים. בתיאור התגובות הקפיד האמן על מה שהוא כינה "הלכי הנפש", כלומר, תיאור אמין ככל הניתן של התגובות האישיות של כל אחד מהשליחים. בניגוד לתגובותיהם הסוערות ישו מתואר במרכז הקומפוזיציה, ראשו ממוסגר באמצעות החלון המרכזי שמאחור, המתפקד כהילה, עיניו עצומות, ידיו פרושות לצדדיו והוא מצוי בשלווה פנימית של קבלת הדין. ראשו של ישו הוא גם נקודת המגוז של כל קווי הפרספקטיבה של היצירה.
הקומפוזיציה מאוזנת, והשליחים מאורגנים סביבו בארבע קבוצות של שלוש דמויות המאוחדות בתנוחתן. יהודה איש קריות, הבוגד, אשר באופן מסורתי היה מתואר מצדו השני של השולחן, ממוקם כאן בקבוצה שלימינו של ישו כשהוא נשען על מרפקו, אוחז את שקיק הכסף שקיבל בעד הבגידה ומביט בישו במבט חמור. ההפרדה שלו מהשליחים האחרים מתבטאת רק בצללית על פניו ובחוסר התנועה שלו. קבוצות השליחים הן (משמאל לימין):
כאשר סופרים את דמויות השליחים ביצירה מגיעים לשתים-עשרה דמויות בסך הכול, כמספר השליחים המוזכרים בברית החדשה: "בָּעֶרֶב בָּא יֵשׁוּעַ עִם הַשְּׁנֵים-עָשָׂר" (לוקס י"ד 17). אלא שהדמות הנשית היושבת משמאל לישו מעלה שאלה בעייתית: האם זו מריה מגדלנה, כפי שמקובל לחשוב, או השליח הצעיר יוחנן בן חלפי המוצג כבעל תווים עדינים ונשיים? ראשית, מריה אינה מוזכרת בסצנה בברית החדשה, ושנית, אם זו מריה, הרי שבן חלפי, הצעיר בשליחים חסר בתמונה, ואם זה הוא, מדוע הוא מתואר כה נשי? שאלה זו נותרה לא פתורה, ויש גרסאות לכאן ולכאן.
מסתורין נוסף האופף את היצירה קשור לסכין המתוארת בין דמותו של יהודה איש קריות ובין פטרוס. מהתיאור לא ניתן לדעת של מי היד האוחזת בה. קיימות שלוש סברות מקובלות:
היד שייכת לדמות הנשית (יוחנן או מריה) ופטרוס אוחז בשורש כף היד. היד שייכת לדמות בלתי נראית – על-פי פרשנות זו הדמות הנשית היא מריה מגדלנה והסכין אחוזה בידו של יוחנן המתחבא מתחת לשולחן.
היד שייכת לפטרוס והוא אוחז אותה בזווית משונה כשידו מכופפת לאחור ומפנה את הסכין הרחק מיהודה איש קריות.
למרות שאין הכרעה מוחלטת בשאלה זו, רישומי הכנה של ליאונרדו מעידים כי כנראה הסברה השלישית היא הנכונה, כיוון שנראית בהם בפירוש תנוחת היד המוזרה של פטרוס.
לאורך ההיסטוריה ידעה היצירה נזקים רבים. כבר בשנת 1517, כתשע-עשרה שנים לאחר סיומה, נאלץ האמן לתקן חלקים ממנה. בשנת 1652, 150 שנים לאחר השלמתה, שברו הנזירים חלק מהקיר כדי לפתוח דלת והציור תוקן לאחר מכן. תיקונים שונים שנעשו לה לאורך המאה ה-19 ובתחילת המאה ה-20 גרמו נזקים כיוון שהמשחזרים חשבו שמדובר בטכניקת פרסקו מסורתית ולא הבינו את הרכבה המיוחד של היצירה. בשנת 1978 נאטם החדר והוצבו בו מכשירי בקרת אקלים ולחות. צוות מומחים החל בתהליך שחזור המתווה המקורי של היצירה על ידי הסרת כל התוספות המאוחרות. בשנת 1999 טופלה היצירה שוב בידי מומחים, וחלקים ממנה הושארו כפי שהיו במקור.